Molekularbiologischer Nachweis von Infektionserregern

Zum Nachweis von Mikroorganismen und zur Analyse von mikrobiellen Biofilmen kombinieren wir molekularbiologische und mikroskopische Verfahren. Durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und PCR können Mikroorganismen direkt im Untersuchungsmaterial nachgewiesen und visualisiert werden.

FISH – Fluoreszenz in situ Hybridisierung

FISH – Fluoreszenz in situ Hybridisierung

FISH Information

FISH ist eine mikroskopische Methode, die die Vorteile von Molekularbiologie, Fluoreszenzmikroskopie und Histologie miteinander vereint.

Durch FISH lassen sich Mikroorganismen im Gewebszusammenhang darstellen und identifizieren, sowie nach Anzahl, Lokalisation und Aktivität quantifizieren.

FISH basiert auf Fluoreszenz-markierten Sonden, die Sequenzspezifisch an die ribosomale RNA (rRNA) der Mikroorganismen binden. So werden Bakterien und Pilze Genus- oder Spezies-spezifisch unter dem Mikroskop sicht- und nachweisbar. Beispielsweise können Sonden entweder alle Bakterien, alle Staphylokokken oder nur Staphylococcus aureus nachweisen. Die FISH misst die (Rest-) Aktivität der Mikroorganismen basierend auf dem Ribosomengehalt auf einem single-cell-level. Nach erfolgreicher Behandlung mit einer anti-mikrobiellen Substanz ist das Fluoreszenzsignal reduziert im Vergleich zu aktiven Biofilmen. So kann direkt der Nachweis der Wirksamkeit von anti-mikrobiellen Substanzen durch Messung der Abnahme der FISH-positiven Zellen und der gesamten Biofilmmasse erfolgen. Die Quantifizierung des Effekts erfolgt über digitale Bildanalyse.

Die FISH ist daher eine ideale Methode für die Analyse von Biofilmen, die Messung anti-mikrobieller Substanzen auf Biofilme und die Entwicklung innovativer Biofilm-abweisender Materialien.

Was leistet die FISH?

  • Identifikation
  • Lokalisation
  • Organisation
  • Aktivität
    der Mikroorganismen

Vorteile der FISH:

  • Identifikation der Erreger in kulturnegativen Fällen
  • Unterscheidung zwischen Kontamination und Infektion
  • Menge und Lokalisation der Erreger
  • Organisation der Erreger (planktonisch oder Biofilm?)
  • Bestimmung des Leitkeims bei gemischten Infektionen
  • Bestimmung der Aktivität der Mikroorganismen
  • Effektivitätsmessung von antimikrobiellen Substanzen oder Verfahren

Molekulare Amplifikations­techniken
PCR | Sequenzierung | NGS | Mikrobiom-Analyse | 16S rRNA Gen

16S rRNA Gen PCR-Amplifikation und Sanger Sequenzierung

Für die Identifikation von Reinkulturen oder Mikroorganismen in Geweben bieten wir die klassische pan-bakterielle Amplifikation des 16S rRNA Gens mit nachfolgender Sequenzierung nach Sanger an.

Bei der PCR (Polymerase Chain Reaction) werden Teilbereiche der Erbsubstanz der Mikroorganismen (z.B. Teile des 16S rRNA-Gens) vervielfältigt und anschließend durch Sequenzierung (nach Sanger oder durch Mikrobiom-Analysen) die Identität der Mikroorganismen analysiert.

Next generation sequencing (NGS) und Mikrobiom-Analysen

Bei Mikrobiom-Analysen wird die Gesamtheit aller Mikroorganismen in einer Probe analysiert. Sie umfasst mehrere Schritte von DNA-Extraktion, Amplifikation, Bar-coding bis hin zum Next Generation Sequencing mit Bioinformatik. Wir bieten diese Analyse für gemischte Kulturen oder Proben mit mehreren Mikroorganismen an. Diese Methode ist insbesondere für gemischte Biofilme sinnvoll.

FISH-Seq

Die Kombination von FISH mit PCR-Amplifikation und Sequenzierung aus Methacrylatschnitten von derselben Probe erlaubt eine bisher unerreichte Präzision und Sensitivität des Nachweises von Mikroorganismen.

 Vorteile sind:

  • besonders hohe Sicherheit bei der Ergebnisinterpretation durch Korrelation des mikroskopischen Bildes mit dem Sequenzierergebnis
  • besonders hohe Sensitivität durch den mechanischen Aufschluss der Mikroorganismen beim Anfertigen von 2µm-Schnitten
  • besonders hohe Spezifität durch eine Vermeidung von kontaminierendem Keim- und DNA-Eintrag während der Probenprozessierung